SICM - Scanning ion conductance microscopy

Prinzip:

 

Funktionsprinzip des pulse-mode SICM. Die Elektrodenspitze wird in einer leitfähigen Badlösung an eine nicht-leitende Oberfläche angenähert bis der Widerstand zwischen Elektrodenspitze und Badelektrode zunimmt. Bei einer vorgegebenen Widerstandsänderung wird die Elektrode angehalten und die Koordinaten aufgezeichnet.

 

SICM:

 

Beispiel einer abgetasteten Zelle aus der weißen Substanz des Schweinegehirns (laterale Auflösung: 0,5 µm, vertikale Auflösung 0,1 µm).

 

Setting up a SICM

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Das SICM wurde von Hasma und Mitarbeitern entwickelt, um die Oberflächen von Isolatoren in leitfähiger Umgebung abzubilden. Die Methode bedient sich eines Feedback-Verfahrens, bei dem eine vorgegebene Leitfähigkeit zwischen der Spitze einer elektrolytgefüllten Glaskapillare und einer Referenzelektrode im Bad konstantgehalten wird. Über die durch Konstanthaltung der Leitfähigkeit erzielte Abstandskontrolle kann die Oberfläche der nicht-leitfähigen Membran abgetastet werden. Die Abbildung lebender Epithel- und Muskelzellen mit diesem Verfahren gelang erstmals Korchev und Mitarbeitern (2).
Das SICM kann auch mit der "Patch-clamp"- Technik kombiniert werden, um die Lage einzelner K+-Kanäle auf Muskelmembranen zu lokalisieren (3). Darüber hinaus können Volumenänderungen von Zellen beobachtet werden (4). Ein besonderer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Zellen berührungsfrei abgetastet werden können, so dass Langzeituntersuchungen von Membranen lebender Zellen mit sub-lichtmikroskopischer Auflösung möglich werden. Wir haben ein neuartiges Ionenleitfähigkeits-Rastermikroskop entwickelt, welches sich von der ursprünglich von Hansma und Mitarbeitern publizierten Methode in einigen Aspekten unterscheidet: Um die Stabilität der Messung zu verbessern, verwenden wir anstelle eines konstanten Stromes zur Steuerung der Annäherung der Elektrode an die Zellmembran kurze Strompulse. Durch Verwendung der Pulse und Bestimmung des Zugangswiderstandes mittels der über der Messkapillare abgegriffenen Potentialdifferenz werden Gleichspannungspotentialschwankungen, die sich bei Messdauern im Stundenbereich kaum vermeiden lassen, eliminiert. Ein weiterer Unterschied unseres Verfahren besteht darin, dass die Elektrode nicht in konstantem Abstand (ca. 100nm - constant distance Modus) über die Membran geführt wird, sondern nach Bestimmung jeder Position zunächst um eine vorwählbare Distanz von wenigen Mikrometern zurückgefahren wird (backstep-modus). Das "constant distance" Verfahren ermöglicht zwar einen schnelleren Rastervorgang, hat aber den Nachteil, dass dann, wenn die Elektrode sich vom Schalenboden aus einem überhängenden Membranabschnitt nähert, die Elektrode in die Membran hineinfahren kann. Mit dieser Methode gelingt es uns nun, komplette Nerven- und Gliazellen in Kulturschalen mit einer Schrittweite von vertikal 0,1 µm und horizontal 0,5 µm innerhalb von ca. einer halben Stunde abzutasten (5). Das Verfahren ist jetzt einsetzbar, um Zellbewegungen und Volumenänderungen im Bereich von 20 Minuten bis einigen Stunden zu beobachten (6,7). In der aktuellen Ausbaustufe ist es möglich, die zu scannenden Zellen unter Phasenkontrastoptik auszuwählen und Zelloberflächen- und Volumina zu quantifizieren, wobei z.B. zwischen Somaoberfäche und Oberfläche der Zellfortsätze unterschieden werden kann. Auf diese Art kann der Einfluss von Wachstumsfaktoren auf Soma- oder Ausläuferoberfläche unterschieden werden (8). Unser Pulsemode-Backstep-SICM ermöglicht die Beobachtung von Zellen über mehrere Stunden (9) und die Quantifizierung von Somaoberflächen und Volumenänderungen bipolarer Zellen(10).

 

Unser SICM wurde im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit W. Schuhmann, welches von der DFG im Normalverfahren gefördert wird (Schuh 929/5-1), und mit Hilfe von Landesgraduiertenstipendien des Landes NRW an Gerd Hoffmann und Stefan Mann zur Anwendungsreife entwickelt.

 

Literatur

1. P.K. Hansma, B. Drake, O. Marti, S. A. Gould, C. B. Prater, Science 243, 641-643 (1989).

2. Y.E. Korchev, C. L. Bashford, M. Milovanovic, I. Vodyanoy, M. J. Lab, Biophys J 73, 653-658 (1997).

3. Y.E. Korchev, Y. A. Negulyaev, C. R. Edwards, I. Vodyanoy, M. J. Lab, Nat.Cell Biol. 2, 616-619 (2000).

4. Y.E. Korchev et al., Biophys J 78, 451-457 (2000).

5. S.A. Mann, G. Hoffmann, A. Hengstenberg, W. Schuhmann, I.D. Dietzel, J Neurosci.Methods 116, 113-117 (2002). article

6. P. Happel, G. Hoffmann, S.A. Mann, I.D. Dietzel: Monitoring cell movements and volume changes with pulse-mode scanning ion conductance microscopy. J. Microsc. 212, 144-51, 2003 article

7. S.A. Mann, P. Happel, G. Hoffmann, I.D. Dietzel: Imaging Living Cells with Scanning Ion-conductance Microscopy. GIT Imaging & Microscopy 1/2004, 40-42, 2004

8. S.A. Mann, J.W. Meyer, I.D. Dietzel: Integration of a scanning ion conductance microscope into phase-contrast optics and its application to the quantification of morphological parameters of selected cells. J Microsc. 2006 Nov;224(Pt 2):152-7. article

9. P. Happel, K. Möller, R. Kunz, I. D. Dietzel: A boundary delimitation algorithm to approximate cell soma volumes of bipolar cells from topographical data obtained by scanning probe microscopy. BMC Bioinformatics. 11:323, 2010 free PMC article

10. P. Happel, I.D. Dietzel: Backstep scanning ion conductance microscopy as a tool for long term investigation of single living cells. J Nanobiotechnology.;7:7, 2009 free PMC articel

 

Praktika zum Thema SICM

Zum Erlernen der SICM Technik bieten wir Praktika, Bachelorarbeiten sowie Spezialisierungspraktika an. Auch im Rahmen einer Masterarbeit kann die SICM Technik angewendet werden.